Alt-R^® CRISPR-Cas9 Systemでは、効率よくゲノム編集を行うために必要なコンポーネントを揃えております。実際にAlt-Rを用いて行った実験結果はこちらをご参照下さい。

Cas9 gRNA
Alt-R^® CRISPR-Cas9 Systemでは、gRNAは2種の機能的コンポーネントに分割して合成・納品しております。

• crRNA – gRNAの前半部分(36塩基)です。2016年4月12日受注分より、エキソヌクレース耐性修飾をcrRNAの両末端に付加しています。
• crRNA-XT – Alt-R^® CRISPR-Cas9 crRNA と比較して、2-O-Methyl塩基など、より強いRNase耐性力を持つ修飾塩基を利用したcrRNAです。
• sgRNA - 99-100塩基のRNAです。1分子内に認識配列を含むcrRNA領域と、Cas9タンパク質を呼びこむtracrRNA領域を含みます。
• tracrRNA – gRNAの後半部分 (67塩基)です。エンドヌクレース及びエキソヌクレース耐性修飾を付加、さらにHPLC精製を行っており、非常に高い品質を誇ります。ATTO^™550 tracrRNAを用いれば、宿主への導入を蛍光顕微鏡で観察したり、導入後の培養細胞をFACsでソーティングする事が可能です。
• Cas9 Control Kits & Control crRNA – コントロール用のキット or crRNA単品です。
• Duplex Buffer–crRNAとtracrRNAをハイブリダイズするための溶液です。tracrRNAに同梱されております。

Cas9 タンパク質

• S.p. Cas9 Nuclease V3 – PAM配列として「NGG」を認識するゲノム編集の代表的なタンパク質です。NLSとC末端に6×Hisを1箇所有しています。本タンパク質を用いるとゲノム編集がより安価に、簡単に行える様になります。是非お試し下さい。
• S.p. HiFi Cas9 Nuclease V3 – 切断効率はそのままに、オフターゲット作用を軽減するCas9バリアントです。
• S.p. Cas9 Nickase V3 – 2本鎖切断を行わず、Target StrandもしくはNon-target strand一方のみを切断するCas9ニッケースです。
• S.p. dCas9 Protein V3 – 切断活性を持たないCas9タンパク質です。

Cas9 プラスミド

• Cas9 expression plasmid – 7.3kbと、一般的なCas9プラスミドより少し短いサイズのプラスミドで、 S.pyogenes のCas9をコードしております。

Cas9 キャリアDNA

• Cas9 Electroporation Enhancer – エレクトロポレーションでのCas9 RNPの導入効率を改善するキャリアDNAです。

HDRドナーオリゴ

• HDR Donor Oligo – HDR用に開発された一本鎖DNA(ssODN)です。HDR効率を向上させる修飾を付加させることができます。また、HDRデザインツールを用いることでHDRドナーオリゴを簡易に設計できます。

ゲノム編集後の変異検出キット

• CRISPR Genome Editing Detection Kits – T7E1を用いた変異導入を確認するためのキットです。PCR と電気泳動で簡単に変異を検出できます。

PAMとして「TTTV」を用いるCRISPR-Cpf1 System

• Cpf1タンパク質は、PAMとして「NGG」ではなく「TTTV」を認識してゲノム編集を行います。
  » 詳細は、Alt-R^® CRISPR-Cpf1 systemページを御覧下さい。(V：A, C or G)

Alt-R^® CRISPR-Cas9 Systemでは、ゲノム編集を「安価で」「容易に」「高効率」で行う事が出来ます。

• 安価に提供しています。
  - Alt-R^® CRISPR-Cas9 Systemは、S.pyogenesのcrRNA・tracrRNAと比較して、Alt-R^® crRNA、Alt-R^® tracrRNAそれぞれ6塩基、22塩基短く設計しております。1塩基当りが高価なRNAでは、塩基数短縮で大きく価格を下げることができます。また、塩基数短縮により簡単に合成できる事も価格を抑える一因です。
• 容易にgRNA complexを作製できます。
  – お客様のお手元に crRNAとtracrRNAは異なるチューブで届きますので、crRNAとtracrRNAをduplex bufferに溶解し、95℃で5分加熱して下さい。その後、室温まで冷却して頂くだけでcrRNA:tracrRNA gRNA complexが作製できます。
• 高効率でゲノム編集を行えます。
  実際に5種のgRNAを用いてゲノム編集の効率を比較してみました。
  用いたgRNAは 1)Alt-R^® crRNA:tracrRNA complex、2) S.pyogenes crRNA:tracrRNA complex、3)in vitro Transcriptionで得られたsgRNA、4)Plasmid sgRNA、5) sgRNA上流にU6プロモーターを付加したgBlocks Fragments（直鎖状二本鎖DNA)です。HEK293-Cas9安定発現株にリバーストランスフェクションにて導入しました。
  Alt-R^®は全体的に高いゲノム編集を示しており、12箇所のうち9箇所で最も効率よく切断できました。
  
  

  図1. 5種のgRNAを用いたゲノム編集効率の測定

高効率にゲノム編集を行える理由

• 修飾を付加したcrRNA及びtracrRNA
  crRNA及びtracrRNAにはそれぞれにヌクレース耐性修飾が付加されています。そのため、より長時間細胞内や受精卵内で機能します。


• tracrRNAの品質
  tracrRNAは67塩基と比較的短いため、高い純度で合成できます。さらに、HPLC精製も行っています。
  

  図2. IDTのtracrRNAは高い純度で精製されている



• gRNA complexのサイズが小さく、自然免疫を引き起こさない
  in vitro Transcriptionで作製したsgRNAを導入した場合、自然免疫による細胞死が観察されました。しかし、このAlt-R^® gRNA complexでは、自然免疫は観察されませんでした。
  

  図3. Alt-R® CRISPR-Cas9 Systemは自然免疫を惹起しない Alt-R® crRNA:tracrRNA complexおよびIVTを、HPRT1の12遺伝子に対して設計しました。IVTおよびAlt-R® crRNA:tracrRNA complexは、Lipofectamin® RNAiMAX Transfection Reagant (Thermo Fisher)を用いてリバーストランスフェクションによりHEK293-Cas9安定発現株に導入しました。一般的なストレス反応遺伝子であるIFIT1(A)とOAS2(B)の発現レベルをそれぞれの導入24時間後に測定しました。 (A)IVTによる顕著なIFIT1の増幅が見られました。 (B)IVTによる顕著なOAS2の増幅が見られました。 (A)(B)ともにAlt-R® crRNA:tracrRNA complexでは、活性は見られませんでした。IFITM1、RIGI、OAS1でも、同様の結果が得られました。

認識配列を含むgRNA complexの前半部分で、ヌクレース耐性修飾が付加されています。
crRNAだけではgRNAとして機能しませんので、使用前にcrRNAをtracrRNAとハイブリダイズさせてgRNA complexを作製して下さい。ご注文には認識配列の19～20塩基のみをご指定下さい。

• 精製グレード：脱塩＋ヌクレース耐性修飾

CRISPR-Cas9 crRNA	価格
Alt-R® CRISPR-Cas9 crRNA, 2 nmol	¥9,800
Alt-R® CRISPR-Cas9 crRNA, 10 nmol	¥13,000

24本以上をご注文の場合、プレートをご利用いただけます。

CRISPR-Cas9 crRNA plate	価格
Alt-R® CRISPR-Cas9 crRNA, 2 nmol, Plate	¥8,300
Alt-R® CRISPR-Cas9 crRNA, 10 nmol, Plate	¥11,000

納期：5-10営業日

Alt-R^® CRISPR-Cas9 crRNA と比較して、2-O-Methyl塩基など、より強いRNase耐性力を持つ修飾塩基を利用したcrRNAです。 gRNAにとって過酷な環境となるほぼ全てのアプリケーションに対して優れた性能を持ちます。
crRNAだけではgRNAとして機能しませんので、使用前にcrRNAをtracrRNAとハイブリダイズさせてgRNA complexを作製して下さい。

• 精製グレード：脱塩＋ヌクレース耐性修飾 (2OMe + PSbond)

CRISPR-Cas9 crRNA XT	価格
Alt-R® CRISPR-Cas9 crRNA XT, 2 nmol	¥16,300
Alt-R® CRISPR-Cas9 crRNA XT, 10 nmol	¥21,300

24本以上をご注文の場合、プレートをご利用いただけます。

CRISPR-Cas9 crRNA XT plate	価格
Alt-R® CRISPR-Cas9 crRNA XT, 2 nmol, Plate	¥13,500
Alt-R® CRISPR-Cas9 crRNA XT, 10 nmol, Plate	¥17,400

Alt-R CRISPR-Cas9 sgRNAは、99-100塩基のRNAです。1分子内に認識配列を含むcrRNA領域と、Cas9タンパク質を呼びこむtracrRNA領域を含みます。認識配列の塩基数(19 - 20)によって塩基長は変化します。他のRNAと同様に化学修飾が付加されています。mRNA Cas9 とともに用いる場合や、RNase活性が高い環境で用いる場合に、切断できる可能性が大きくなります。

• 精製グレード：脱塩＋ヌクレース耐性修飾 (2OMe + PSbond)

CRISPR-Cas9 sgRNA	価格
Alt-R® CRISPR-Cas9 sgRNA, 2 nmol	¥21,600
Alt-R® CRISPR-Cas9 sgRNA, 10 nmol	¥38,300

24本以上をご注文の場合、プレートをご利用いただけます。

CRISPR-Cas9 sgRNA plate	価格
Alt-R® CRISPR-Cas9 sgRNA, 2 nmol, Plate	¥21,600
Alt-R® CRISPR-Cas9 sgRNA, 10 nmol, Plate	¥38,300

	crRNA	crRNA-XT	sgRNA
修飾	RNase 耐性力を持つ 簡易な修飾	より強いRNase 耐性力を 持つ修飾	より強いRNase 耐性力を 持つ修飾
価格	¥9,800	¥16,300	¥21,600
gRNAの 選択基準	通常はこのcrRNAを利用します。通常の培養細胞や受精卵へのRNPでの導入に。スクリーニングも安価で実施できます。	gRNAをmRNA やプラスミドなど、RNP以外の形態で細胞に導入する場合の選択肢です。スクリーニングにおいて、効率UPと価格のバランスが良いです。	crRNAではなくcrRNA-XTを利用したが、ゲノム編集効率が改善できず、より強いRNase 耐性力を持つgRNA で試してみたい場合。
試行優先度	最初の選択肢	第二の選択肢	第三の選択肢

HPRTの12種類のターゲットサイトに対して、3つのgRNAフォーマットでRNPを導入しました。3つのgRNAフォーマットとは、crRNA:tracrRNA 複合体、 crRNA XT:tracrRNA 複合体、 sgRNA です。2種類の濃度で実験を行いました（図4）。

図4. RNPで導入を行った場合、各gRNAフォーマットによる切断効率の大きな変化は見られなかった。 3種のgRNAフォーマット（crRNA、 crRNA XT、 sgRNA)を用いて、12種のHPRTのターゲットサイトに対するRNPを形成した。RNPのタンパク質には、Alt-R Cas9 Nucleaseを用いた。4 µM もしくは 0.25 µM のRNP(Cas9 Nuclease:gRNA, 1:1.2)を調整し、2 µMのAlt-R Cas9 EnhancerとともにエレクトロポレーションでHEK-293細胞に導入した。ゲノムDNAは48時間後に抽出し、切断効率はNGSで測定した。

次に、3種のgRNAフォーマットとmRNAを培養細胞に導入しました。HPRTの2ヶ所のターゲットサイトにおいて、gRNAのフォーマットの違いが切断効率に影響することが分かります。

図5. mRNAとともにgRNAを導入する場合、ターゲットサイトの中には、gRNAへの強固な修飾が必要な場合もある 2ヶ所のHPRTのターゲットサイトに対するgRNAフォーマット(4 µM)を、1µgのCas9 mRNAとともにHEK-293細胞に導入した。ゲノムDNAは48時間後に抽出し、切断効率はNGSで測定した。

IDTでは、crRNAの設計に有用なIDT CRISPR-Cas9 Design Toolを提供しております。（対応宿主：ヒト、マウス、ラット、ゼブラフィッシュ、線虫）
» crRNAの設計方法はこちら

IDTでは、検索により取得したプレデザインcrRNAについては、crRNAとtracrRNAとCas9蛋白質からなるRNP複合体として利用した場合、ターゲットに対して十分なゲノム編集が起こることを保証しています。

もしも、ポジティブコントロールでゲノム編集が確認されている一方で、プレデザインのcrRNAでゲノム編集が起こっていないことが観察された場合は、IDTのテクニカルサポートにご連絡いただき、担当者とのディスカッションでIDT側で承認された場合に限り、当該crRNAに対して1回のみ無償で他のプレデザインのcrRNAをご提供します。
※　連絡先　テクニカルサポート担当　 japan-cc@idtdna.com

なお、このデザイン保証のプログラムは、crRNAの無償提供に限ります。その他の試薬や実験の費用や負担を補償するものではありません。

gRNA complex の後半部位で、Alt-R^® crRNAとハイブリダイズさせてgRNA complexを作製します。ヌクレース耐性修飾が施されているため、細胞内でより長く機能します。tracrRNAは共通部位のため、異なる部位のゲノム編集を行う場合は、crRNAのみ変更して下さい。

• 精製グレード：HPLC

CRISPR-Cas9 tracrRNA	価格	Cat#
Alt-R® CRISPR-Cas9 tracrRNA 5 nmol	¥12,000	1072532
Alt-R® CRISPR-Cas9 tracrRNA 20 nmol	¥25,000	1072533
Alt-R® CRISPR-Cas9 tracrRNA 100 nmol	¥64,000	1072534

※Nuclease-Free Duplex Bufferが同梱されます。

納期：3 ～ 5 営業日

gRNA complex の後半部位で、Alt-R^® crRNAとハイブリダイズさせてgRNA complexを作製します。 Alt-R^® CRISPR-Cas9 tracrRNA – ATTO^™ 550をFACsと併用する事で、ゲノム編集効率を向上させることができます。

• 精製グレード：HPLC

CRISPR-Cas9 tracrRNA	価格	Cat#
Alt-R® CRISPR-Cas9 tracrRNA, ATTO™ 550, 5 nmol	¥17,000	1075927
Alt-R® CRISPR-Cas9 tracrRNA, ATTO™ 550, 20 nmol	¥34,700	1075928

※Nuclease-Free Duplex Bufferが同梱されます。

納期：3 ～ 5 営業日

・導入効率のモニタリングについて

Alt-R^® CRISPR-Cas9 tracrRNA – ATTO^™ 550は、導入効率のモニタリングに効果的なツールです。蛍光顕微鏡下でgRNAやRibonucleoprotein(RNP)の導入効率が観察できるため、導入の最適化やトラブルシューティングが行えます。 »詳細（アプリケーションノート）はこちら

図6. HEK-293 Cas9導入株へのATTO™550 gRNAの導入 Alt-R® CRISPR-Cas9 crRNA(未標識)とAlt-R® CRISPR-Cas9 tracrRNA – ATTO™ 550のgRNA complexを調製後(終濃度10 nM)、HEK-293 Cas9導入株へリバーストランスフェクション(RNAiMAX™ reagent, Thermo Fisher Scientific) した。写真は導入48時間後。倍率：10倍

・FACsによるRNP導入細胞の単離について
crRNAとATTO^™標識tracrRNAで形成されたgRNA complexとCas9タンパク質の複合体でゲノム編集を行えます。このATTO^™標識RNPを 細胞に導入し、をFACsでソーティングする事で、RNPが導入された細胞をエンリッチできます。RNP導入細胞が選択的に得られるため、ソーティングされた細胞集団では、ゲノム編集効率が向上します。(図7)

図7. ソーティングによりゲノム編集効率は向上する HEK-293及びJurkat細胞に0.5 uMのRiboNucleaoProtein (RNP)をNeon® electropolator system(Thermo Fisher)及びキャリアDNA（Alt-R Cas9 Electroporation Enhancer)を用いて導入した。RNPはAlt-R® S.p. Cas9 Nuclease V3と、Alt-R® crRNA及びAlt-R® tracrRNA - ATTO® 550で構成した。RNP導入24時間後の細胞をソーティングし、陽性細胞のみを再播種しさらに48時間培養した。対して「Unsorted」グループはコントロールとして再播種のみを行った。計72時間の培養後、QuickExtract® solution (Epicentre)を用いてゲノムDNAを抽出した。なお、ゲノム編集効率の測定は、Alt-R Genome Editing Detection Kit (T7E1アッセイ)を用いた。

各種コントロール用のKit、crRNA単品、プライマーをご用意しております。

CRISPR-Cas9 control kits	価格	Cat#
2 nmol Alt-R® CRISPR-Cas9 Control Kit Human	¥19,500	1072554
2 nmol Alt-R® CRISPR-Cas9 Control Kit Mouse	¥19,500	1072555
2 nmol Alt-R® CRISPR-Cas9 Control Kit Rat	¥19,500	1072556

＜Kit 内容品＞
・5 nmol Alt-R® CRISPR-Cas9 tracrRNA
・Alt-R® CRISPR-Cas9 HPRT Positive Control crRNA
・Alt-R® CRISPR-Cas9 Negative Control crRNA #1
・Alt-R® HPRT PCR Primer Mix
・Nuclease-Free Duplexing buffer

CRISPR-Cas9 Controls (kit内容の各crRNAの単品販売です)	価格	Cat#
2 nmol Alt-R® CRISPR-Cas9 Negative Control crRNA #1	¥12,300	1072544
2 nmol Alt-R® CRISPR-Cas9 Negative Control crRNA #2	¥12,300	1072545
2 nmol Alt-R® CRISPR-Cas9 Negative Control crRNA #3	¥12,300	1072546
2 nmol Alt-R® CRISPR-Cas9 Human HPRT Pos Ctrl crRNA	¥12,300	1072541
2 nmol Alt-R® CRISPR-Cas9 Mouse HPRT Pos Ctrl crRNA	¥12,300	1072542
2 nmol Alt-R® CRISPR-Cas9 Rat HPRT Pos Ctrl crRNA	¥12,300	1072571

Control PCR primer mixes (kit内容の各crRNAの単品販売です)	価格	Cat#
2 nmol (ea.) Alt-R® HPRT PCR Primer Mix Human	¥5,800	1072551
2 nmol (ea.) Alt-R® HPRT PCR Primer Mix Mouse	¥5,800	1072552
2 nmol (ea.) Alt-R® HPRT PCR Primer Mix Rat	¥5,800	1072553

納期：3 ～ 5 営業日

Nuclease Free BufferはtracrRNAに同梱されておりますので、足りなくなった場合にお使い下さい。

Duplex Buffer	価格	Cat#
10 x 2 mL Nuclease Free Duplex Buffer	¥3,000	11-01-03-01
300 mL Nuclease Free Duplex Buffer	¥3,000	11-05-01-12

納期：3 ～ 5 営業日

Alt-R^® S.p. Cas9 Nuclease V3はS.pyogenes 由来のCas9 endonucleaseで、PAMとして「NGG」を認識します。gRNAやcrRNA：tracrRNA gRNA complexと複合体を形成し、ターゲット特異的に二本鎖DNAを切断します。
このタンパク質は核移行シグナル(NLS)とC末端に6-His TagC末端を含みます。

製品名	価格	濃度	納品形態	Cat#
Alt-R® S.p. Cas9 Nuclease V3, 100 µg	¥23,400	10μg/μL	50% グリセロール	1081058
Alt-R® S.p. Cas9 Nuclease V3, 500 µg	¥83,400			1081059

納期：1 ～ 2 営業日
輸送・保管：-20℃

・オフターゲットについて
Alt-R^® S.p. Cas9 Nuclease V3は、RNPとして二本鎖を切断後、迅速に細胞内で分解され、活性を制御できるのでオフターゲットを減らすことができます。

・細胞へのダメージについて
プラスミドをトランスフェクションした場合、ゲノムへの取り込みにより内在性の遺伝子を変化させてしまうことが懸念されます。またmRNAのトランスフェクションは自然免疫を引き起こすことが知られています。RNPの状態であればこのような細胞へのダメージは観察されていません。

・導入効率について
Cas9タンパク質とAlt-R^® crRNA:tracrRNA complexでRNP複合体を形成し、トランスフェクションする方法は導入効率が高く、Cas9を「プラスミドを用いた場合」、「mRNAを用いた場合」と比較して、最も効率良く切断できます。(下図)

図8. Alt-R® CRISPR-Cas9システムを使用した切断活性はRNPの状態が最も効率が良い Alt-R CRISPR HPRTコントロール crRNAとtracrRNAの複合体をCas9発現プラスミド、Cas9 mRNA、Cas9タンパク質（crRNA：tracrRNAとRNP複合体を形成）をHEK293（ヒト)、Hepa1-6(マウス)、RG2(ラット)にそれぞれトランスフェクションした。 いずれの種でもRNPの導入はmRNA、プラスミド導入よりも効果が高かった。また、HEK293にRNPを導入した場合の効率は、これまで高い効率が得られていたHEK293-Cas9安定発現株と同様であった。 トランスフェクション試薬はRNAiMAX（Thremo Fisher）を使用。ノックアウト効果はT7E1アッセイ(CRISPR Genome Editing Detection Kits)により評価した。

CRIPSR-Cas9の懸念点であるオフターゲット作用に対処するため、IDTは高性能なS.p. Cas9を開発しました。この新しいCas9バリアントは劇的にオフターゲット作用を軽減するにも関わらず、野生型のCas9の切断活性を維持しています。

製品名	価格	濃度	納品形態	Cat#
Alt-R® S.p. HiFi Cas9 Nuclease V3, 100 µg	¥28,000	10μg/μL	50% グリセロール	1081060
Alt-R® S.p. HiFi Cas9 Nuclease V3, 500 µg	¥99,000			1081061

納期：1～2 営業日
輸送・保管：-20℃


・切断効率とオフターゲット作用について

図9. Alt-R® S.p. HiFi Cas9 Nuclease 3NLSは、オフターゲット作用は低減されるが、高い活性を維持している (RNP導入時) EMX1, HEKSite4, VEGF3 に対するAlt-R crRNA:tracrRNA gRNA複合体と下記4つのCas9タンパク質でRNP複合体を形成させた。 ■ 野生型Cas9 (Alt-R® S.p. Cas9 Nuclease 3NLS) ■ Alt-R Hifi Cas9 Nuclease 3NLS ■ SpCas9-HF1 (Kleinstiver et al., Nature 529:490–495) ■ eSpCas9 (Slaymaker et al., Science 351:84–88) 複合体(10 nM)をLipofectamine® RNAiMAX(Thermo Fisher)を用いて、HEK-293細胞にリバーストランスフェクションし、48時間後にDNAを抽出した。ゲノム編集効率は、オンターゲット及びオフターゲットが疑われる部位をPCRで増幅後、Fragment Analyzer™ システム(Advanced Analytical)用いて、T7E1アッセイで測定した。エラーバーは標準誤差を示しています。なお、オンターゲット、オフターゲットとして測定した配列は、図の下部に示しています。(赤色は認識部位のミスマッチ、青色はPAMサイトのミスマッチを示しています。）

図10. Alt-R® S.p. HiFi Cas9 Nuclease 3NLSは、オンターゲット部位に対して野生型同様の高い切断活性を有している human HPRT遺伝子の12箇所に対してデザインしたcrRNAを、それぞれをtracrRNAとアニールさせ、crRNA:tracrRNA gRNA複合体を形成させた。さらにそれらを下記の4つのCas9バリアントとRNP複合体を形成させた。 ■ 野生型Cas9 (Alt-R® S.p. Cas9 Nuclease 3NLS) ■ eSpCas9 (Slaymaker et al., Science 351:84–88) ■ SpCas9-HF1 (Kleinstiver et al., Nature 529:490–495) ■ Alt-R Hifi Cas9 Nuclease 3NLS 複合体(10 nM)をLipofectamine® RNAiMAX(Thermo Fisher)を用いて、HEK-293細胞にリバーストランスフェクションし、48時間後にDNAを抽出した。オンターゲット部位に対しCRISPR Genome Editing Detection Kitsを用いてT7E1アッセイを行い、ゲノム編集効率を測定した。 Alt-R® S.p. HiFi Cas9 タンパク質は、これまで報告されているオフターゲット軽減Cas9バリアントと比較して、様々なサイトに対し、高いレベルのゲノム編集効率を保持している。

こちらも併せてご覧ください
» 簡便にゲノム編集の変異導入効率が測定できるT7EIアッセイとは

核移行シグナルとC末端にHisタグを含んでいます。Alt-R^® S.p. Cas9 D10A Nickase V3は、DNAのtarget Strandのみ、Alt-R^® S.p. Cas9 H840A Nickase V3は、non-target strandのみを切断します。
Cas9 nickase 100 µgは、610 pmolに相当し、大腸菌で発現・精製を行っています。

製品名	価格	濃度	納品形態	Cat#
Alt-R® S.p. Cas9 D10A Nickase V3, 100 µg	¥23,400	10μg/μL	50% グリセロール	1081062
Alt-R® S.p. Cas9 D10A Nickase V3, 500 µg	¥83,400			1081063
Alt-R® S.p. Cas9 H840A Nickase V3, 100 µg	¥23,400	10μg/μL	50% グリセロール	1081064
Alt-R® S.p. Cas9 H840A Nickase V3, 500 µg	¥83,400			1081065

納期：約1週間
輸送・保管：-20℃

切断箇所の模式図

» Cas9バリアントの比較表はこちら(Alt-R Cas9 Nuclease、Alt-R HiFi Cas9 Nuclease, Alt-R Cas9 Nickases)

S. pyogenes dCas9のリコンビナントタンパク質です。核移行シグナル(NLS)と、C末端に6 x Hisタグを含んでいます。
dCas9 Protein 100 µgは、610 pmolに相当し、大腸菌で発現・精製を行っています。

製品名	価格	濃度	納品形態	Cat#
Alt-R® S.p. dCas9 Protein V3, 100 µg	¥23,400	10μg/μL	50% グリセロール	1081066
Alt-R® S.p. dCas9 Protein V3, 500 µg	¥83,400			1081067

納期：約1週間
輸送・保管：-20℃

Alt-R S.p. Cas9 Nuclease V3は、広範囲のサイトに対し、ゲノム編集の効率を最大化するためにデザインされました。 核移行シグナルなどの改変により、発現したタンパク質が核に対して移行しやすくなったため、様々なサイトに対して、切断効率が改善されました。（図11)

図11. Alt-R S.p. Cas9 Nuclease V3は、ゲノム編集効率を最大化させる リボヌクレオプロテイン（RNP)複合体を2種のタンパク質でそれぞれ形成した。Alt-R S.p. Cas9 Nuclease 3NLS を 水色、Alt-R S.p. Cas9 Nuclease V3 を紺色で示す。ヒトHPRT遺伝子の11種のサイトに対し、gRNAにAlt-R crRNA:tracrRNA複合体を用いた。RNP複合体(4 µM)は、HEK-293細胞にNucleofectionにて導入した。編集効率はNGSによって測定した。

Alt-R Cas9 Nuclease V3と同様にAlt-R S.p. HiFi Cas9 Nuclease V3の切断効率が向上しました。
しかしながら、HiFi Cas9 V3の特異性は保持されており、下図に示す通りオフターゲットを最小限に抑えられています。

図12. Alt-R S.p. HiFi Cas9 Nuclease V3 は、WT Cas9に近い切断活性を持つが、オフターゲットを顕著に抑制する Alt-R S.p. Cas9 Nuclease V3 及び Alt-R S.p. HiFi Cas9 Nuclease V3 を用いてRNP複合体を形成した。gRNAにはEMX1遺伝子に対するAlt-R crRNA:tracrRNA 複合体を用いた。RNP複合体(4 µM)は、HEK-293細胞にnucleofectionにて導入した。オンターゲット及び9ヶ所のオフターゲット部位のINDELの形成をNGSによって測定した。

STEP1 Alt-R^® gRNA complexの調製
Alt-R^® gRNA complex を調製します。gRNA complexは非常に簡便に調製できます。

1. 100 µM crRNA と 100 µM tracrRNA を duplex bufferに1 µLずつ加え、計100 µLにします。95℃で5分インキュベート後、室温に戻します。
   ※30uM のAlt-R^® gRNA complex は、-20℃で10ヶ月保存しても使用出来ます。 »詳しくはこちら

SETP2 RNP complexの調製
Cas9 NucleaseとSTEP1で作製したgRNA Complexの複合体(RNP)を形成させます。

1. リポフェクションの場合はCas9:gRNAを1:1で。エレクトロポレーションの場合は、1:1.2で調製し、室温で5分インキュベートします。
   ※RNPは4度もしくは-80度で5ヶ月間保存しても使用出来ます。»詳しくはこちら

STEP3 RNPの導入
STEP2で調整したRNPを目的の細胞に導入します。

STEP4 CRISPR Genome Editing Detection Kits を用いた変異検出
弊社では、CRISPR Genome Editing Detection Kits を用いて、変異の検出を行っております。 本キットを用いれば、PCR と電気泳動で簡単に変異を検出できます。T7E1 は 2 塩基以上の変異の検出に優れており、ゲノム編集による遺伝子改変の検出に最適です。

なお、各 STEP の詳細は下記ページの Protocol（Alt-R^® CRISPR-Cas9 System User Guide）をご参照ください。
>> IDT Alt-R^® CRISPR-Cas9 system ページ

Cas9 expression plasmid	価格	Cat#
Alt-R® S.p. Cas9 Expression Plasmid	¥12,800	1072566

納期：3 ～ 5 営業日

Alt-R^® CRISPR-Cas9 Systemでは、Cas9 Expression plasmid も取り扱っております。
Alt-R^® gRNA complex 導入の 24 時間前に Cas9 Expression Plasmid を導入することで、十分量の Cas9 を発現させることが出来ます。弊社で扱っている Cas9 Expression Plasmid は、7.3 kb と通常の Cas9 発現プラスミド (9.2 kb) と比較すると少し小さく設計されています。これは、プラスミドサイズと細胞への導入効率が反比例するためプラスミドサイズの最小化を図ったためです。（下図)

図13.　導入するプラスミドサイズと、導入効率の比較 9.2 kb の sgRNA + Cas9 plasmidと比較して、4.7 kbのeGFP Plasmid がより細胞に導入されやすいのが分かります。

ご購入頂いたAlt-R^® 製品は96wellプレート下記well数分ご使用いただけます。

製品名	RNPとして使用した場合	Expression Plasmidを別途導入する場合
Alt-R® CRISPR-Cas9 crRNA, 2 nmol	1,332 well	444 well
5 nmol Alt-R® CRISPR-Cas9 tracrRNA	3,330 well	1110 well
100 µg Alt-R® S.p. Cas9 Nuclease V3	400 well	-

その他のディッシュやプレートでの計算結果は、下記ページの Alt-R^® CRISPR-Cas9 System User Guideの Appendix B をご参照ください。
>> IDT Alt-R^® CRISPR-Cas9 system ページ

Alt-R^® HDR エンハンサー(Alt-R HDR Enhancer) とは、ノックイン効率を改善するための低分子化合物です。 Jurkat、HEK293、Hela、K562など、様々な細胞に対してHDR効率の向上が期待できます。

製品名	価格	濃度	Cat#
Alt-R® HDR Enhancer, 100 µL	¥10,500	3mM in DMSO	1081072
Alt-R® HDR Enhancer, 500 µL	¥32,500		1081073

納期：約1週間
輸送：常温
保管：-20℃ (有効期間：6ヶ月)

図14. Alt-R HDRエンハンサーは、複数種の細胞に対してHDR効率を改善する 4µMのRNP複合体（IDT Alt-R）と3µMの一本鎖DNA(Ultramer)を、複数のセルラインのhuman HPRTに対してAmaxa Nucleofector System (Lonza)を用いて導入した。導入後、30µMのHDRエンハンサーもしくはDMSOを含む溶液で培養した。 HEK293、HeLa細胞は48時間、Jurkat、K562細胞は72時間後に単離し、HDR効率を測定した。HDRでEcoRI配列を付加し、制限酵素による切断で効率を測定した。

HDRドナーオリゴは、最大200塩基まで合成できる高品質なHDR対応オリゴ(1本鎖DNA) で、ポイントミューテーションや、タグ配列などの短鎖の挿入に適しています。

HDR ドナーオリゴは、HDR効率を向上させるために、両末端に修飾を付加することができます(図15)。

図15. ドナーオリゴに対する修飾の模式図 選択できる修飾形式は3種類あります。 修飾を行わない未修飾形式(Unmodified)、各末端に2つのホスホロチオエート（PS）結合を施したPS修飾 (PS modified)、PS修飾にさらにIDT独自のブロッキング修飾を施したAlt-HDR修飾（Alt-R HDR modified)です。

図16. Alt-R HDR修飾を付加したドナーオリゴは、他の修飾と比べて高いHDR効率を示す。 4つの遺伝子座をターゲットとしたRNP複合体（2 µM）を、0.5 µMの一本鎖HDRドナーオリゴとともに、4D-Nucleofector™システム（Lonza）を用いたエレクトロポレーションによってJurkat細胞およびHeLa細胞へ導入した。 RNP複合体には、Alt-R S.p. HiFi Cas9 Nuclease V3ならびにAlt-R CRISPR-Cas9 crRNA、tracrRNAを用いた。 ドナーオリゴには、未修飾 (Unmodified)、PS修飾 (PS modified）、Alt-R HDR修飾 (Alt-R HDR modified）の3種を用いた。 ゲノムDNAはエレクトロポレーションから48時間後（HeLa）または72時間後（Jurkat）に抽出した。HDR効率は、Illumina™ MiSeq™システム（v2 chemistry、150 bp ペアエンドリード）にてアンプリコンシーケンシングで測定した。

製品名	価格
Alt-R HDR Donor Oligo, 2 nmol	¥16,000
Alt-R HDR Donor Oligo, 10 nmol	¥22,000
Alt-R HDR Donor Oligo, 2 nmol, plate	¥16,000
Alt-R HDR Donor Oligo, 10 nmol, plate	¥22,000

納期：約2週間
輸送：常温
保管：-20℃ (有効期間：6ヶ月)

HDR ドナーオリゴとAlt-R HDR エンハンサーの併用が、HDR効率及ぼす影響を実験により確かめました。
併用によってHDR効率がさらに向上することが確認されました（図17)。

図17. Alt-R HDR ドナーオリゴをAlt-R HDR エンハンサーと併用すると、HDR効率がさらに向上した。 3つの遺伝子座をターゲットとしたRNP複合体（2 µM）を、0.5 µMのHDRドナーオリゴとともに、4D-Nucleofector™システム（Lonza）を用いたエレクトロポレーションによってHeLa細胞へ導入した。 RNP複合体には、 Alt-R S.p. HiFi Cas9 Nuclease V3 ならびにAlt-R CRISPR-Cas9 crRNA、tracrRNAを用いた。 ドナーオリゴには、未修飾(Unmodified)、PS修飾(PS modified)、またはAlt-R HDR修飾(Alt-R HDR modified) を用いた。 エレクトロポレーションの直後に、30 µMのAlt-R HDR エンハンサーを含む培地、または含まない培地にて細胞を培養し、ゲノムDNAはエレクトロポレーションから48時間後に抽出した。HDR効率は、Illumina™ MiSeq™システム（v2 chemistry、150 bp ペアエンドリード）にてアンプリコンシーケンシングで測定した。

エレクトロポレーションでゲノム編集の効率を高める1本鎖DNAです。RNPの導入が難しい宿主や、効率が充分でない時に本製品を用いるとゲノム編集の効率が改善する場合があります（下図）。本製品はCas9用にデザインされておりますので、Cpf1用のElectroporation Enhancerとはご互換性がありません。なお本配列はヒト、ラット、マウスの配列を避けてデザインしております。

図18.エレクトロポレーションでRNPを導入する際、Alt-R® Cas9 Electroporation Enhancerを添加するとゲノム編集効率が向上します。 A.K562、B.Jurkat 細胞にAmaxa® System (Lonza)を用いて、0.125-4uM RNPを導入した際のゲノム編集効率を示します。4uMのAlt-R® Cas9 Electroporation Enhancerを加えた場合を「Dark Blue」、加えていない場合を「Light Blue」で示しています。

製品名	価格	Cat#
Alt-R® Cas9 Electroporation Enhancer, 2 nmol	¥5,900	1075915
Alt-R® Cas9 Electroporation Enhancer, 10 nmol	¥17,600	1075916

納期：2 ～ 4営業日

ゲノム編集やその効率を簡便に検証するためのキットです。ヘテロ二本鎖を切断する酵素(T7E1)で切断された断片を電気泳動で評価します。CRISPRだけでなく、ゲノム編集全般に使用出来ます。

製品名	価格	Cat#	納期
Alt-R® Genome Editing Detection Kit, 25 rxn	¥16,800	1075931	1 ～ 2 営業日
Alt-R® Genome Editing Detection Kit, 100 rxn	¥56,000	1075932
Alt-R® Genome Editing Detection Kit, 1000 rxn	¥480,000	1075933	～2週間

輸送・保管：-20℃


こちらも併せてご覧ください
»簡便にゲノム編集の変異導入効率が測定できるT7EIアッセイとは

ウェブサイトからご注文下さい。非常に簡単にご注文頂けます。
>> ウェブサイトの使用方法はこちら

下記ページより必要なプロトコール・ユーザーガイドをご取得下さい。
>> IDT Alt-R^® CRISPR-Cas9 system ページ ▲Resources

プロトコールではありませんので、トラブルシューティングは出来ませんが、参考になるかと存じます。
マウスの受精卵やES細胞での実験結果を一覧にしています。
» ユーザーボイス of Alt-R^® CRISPR-Cas9 System

200塩基まで合成出来る一本鎖オリゴ合成サービス
>> Ultramer DNAサービス

エレクトロポレーション：遺伝子組み換え齧歯類を作製するためのマイクロインジェクションの代替法

マウスの受精卵にマイクロインジェクションではなく、エレクトロポレーションでゲノム編集を行う方法と、実際に金子先生が実験された際のデータを公開しています。マウス受精卵に対するプロトコールだけではなく、iPS細胞に対するエレクトロポレーションを用いたゲノム編集のプロトコールも掲載しています。

Cas9 RNPは活性を保持したままどのくらい保存できる？

Alt-R^® Cas9:crRNA:tracrRNA リボヌクレオタンパク質 (RNP) 複合体を形成後、再度そのRNPを細胞に導入したい場合、何度でどの程度保存すれば、再度そのRNPを用いてゲノム編集を行うことができるのかを実験しました。

アプリケーションノート - HDR実験の最適化

HDR実験を最適化するためにIDTが行ってきた研究や実験をまとめたアプリケーションノートです。HDRを最適化するためのcrRNAの設計方法や、ssODNドナーテンプレートのデザイン（長や切断サイトからの距離）、精製の必要性など、IDTが膨大な実験によって発見したHDRに関連する情報を紹介しています。

» 本製品を用いた最新の論文はこちら

Q. Duplex bufferの組成を教えてください

A. Duplex bufferの組成は下記の通りです。このバッファーに毒性が無い事は確認済みです。
100 mM Potassium Acetate
30 mM HEPES

Q. RNAが常温で届きましたが、問題無いですか？

A. 問題ありませんので、ご安心ください。ただし、長期保存は-20℃で行って下さい。

Q. crRNAとtracrRNAのアニーリングに、Duplex Bufferは必須ですか？

A. Duplex Buffer以外でも、アニーリング出来ます。目安として、一価カチオン濃度が40 mM以上のバッファーであればアニーリング出来る可能性は高いです。しかしながら、必ずアニーリングする保証は出来ないこと、トラブルシューティングの対象にならない事はご承知おきください。

Q. crRNA、tracrRNA、Cas9 Nucleaseの納品量(質量)を教えてください。

A.下記の表をご参照下さい。crRNAの分子量は概算値です。正確な分子量は納品時のスペックシートをご参照下さい。

製品名	分子量	納品量
Alt-R® CRISPR-Cas9 crRNA, 2 nmol	約11700	約23μg
Alt-R® CRISPR-Cas9 crRNA, 10 nmol	約11700	約114μg
5 nmol Alt-R® CRISPR-Cas9 tracrRNA	22182.3	110.9μg
20 nmol Alt-R® CRISPR-Cas9 tracrRNA	22182.3	443.6μg
100 nmol Alt-R® CRISPR-Cas9 tracrRNA	22182.3	2218.2μg
100 µg Alt-R® S.p. Cas9 Nuclease 3NLS	163,700	610.9 pmol
500 µg Alt-R® S.p. Cas9 Nuclease 3NLS	163,700	3054.4 pmol

こちらのエクセルでも簡単に単位変換が可能です。
モル/濃度計算
※2016/10/01 更新

Q. crRNAを注文するときはPAM配列は必要ですか？

A. 必要ありません。PAM配列の上流の配列のみをご入力してください。

Q. "NGG"以外のPAMを持つタンパク質の扱いあはありますが？

A. "TTTV"というPAMを持つCpf1タンパク質の取り扱いがございます。（V： A, C, or G）
» 詳細は、Alt-R^® CRISPR-Cpf1 systemページヘ

Q. crRNA：tracrRNA gRNA complexやRNPの保存と活性について

A.crRNA：tracrRNA gRNA complexについて
30uM crRNA：tracrRANの複合体を23度、4度、-20度で10ヶ月保存してもゲノム編集が行えることを確認しています。
» The spectrum of NHEJ products following CRISPR/Cas9 DNA cleavage is target site dependent
左下Cの図を参照して下さい。

A.RNPについて
RNP形成後でも4度もしくは-80度で5ヶ月間保存しても活性を保っていることを確認しています。
詳細は、Decoded Japanでも解説していますので、こちらをご参照下さい。

Q. 宿主導入前や導入後のスクリーニングで、gRNAの切断チェックを行いたいのですが...

A.in vitro切断のプロトコールを公開していますので、こちらをご参照下さい。
» PDF tag Alt-R CRISPR-Cas9 protocol—in vitro cleavage of target DNA with RNP complex

他にも様々なプロトコールを公開しています。ぜひこちらも併せてご参照下さい。

Q. HDR Enhancerはどのような物質ですか？

低分子化合物です。詳細は開示されておりません。
なお、法規制には非該当です。

なお、物質名は開示されていないため、お客様の施設で物質名が非開示の製品が利用できない場合には、申し訳ございませんが本製品の利用はお勧めできません。 安全データシート（SDS）は下記からダウンロード頂けます。 http://sfvideo.blob.core.windows.net/sitefinity/docs/default-source/safety-data-sheet/hdr-enhancer.pdf?sfvrsn=fc740707_4

Q. HDR Enhancerの保存方法について、詳しく教えて下さい。

HDR Enhancerは輸送時は室温です。
お手元に届きましたらチューブに記載の通り、-20℃保存をお願いいたします。

IDT社内のfunctionalチェックでは、3ヶ月間-20℃保存品にくらべて3ヶ月室温保存品のHDRノックイン効率が5%低かったとの結果を得ています。

凍結融解に関して
IDTでは5回の凍結融解による効率の低下がないことを確認しており、凍結融解による品質の劣化は無いと考えております。ただし、より長期間にわたりより頻度の多い凍結融解の場合の影響は出てくる可能性も可能性はありますので、気になる場合には小分け分注をお勧めいたします。

Q. HDR Enhancerは遮光容器に封入されていますが、遮光保存が必要ですか？

HDR Enhancerの化合物そのものには光の影響はありませんが、DMSOが影響を受ける可能性があるため、遮光チューブに入れて納品しております。

Q. HDR Enhancerは、マウス細胞や受精卵でも使用可能か？

マウス細胞については、H36.12細胞で利用した際に効率が上がることは確認しております。

マウスの受精卵については、米国IDTおよび共同研究者にての実施例の情報はございません。今後、情報が入りましたらお知らせいたします。

Q. HDR Enhancerは、リポフェクションでも使用可能か？

こちらも、残念ながら現時点では、米国IDTおよび共同研究者にての実施例はございません。
今後、情報が入りましたらお知らせいたします。

Q. HDR Enhancerのポジティブコントロールの配列を教えてください。

IDTでは下記のポジティブコントロールを用いています。 IDTのポジティブコントロール
HPRT38087-AS crRNA sequence
AATTATGGGGATTACTAGGA

ssODN HDR template sequence (40 nucleotides homology arms, EcoRI insert at Cas9 cutsite)
AAAGACTATGAAATGGAGAGCTAAATTATGGGGATTACTAgaattcGGAAGGGGCAGCAATGAGTTGACACTACAGACAAGGCACT

Q. HDR Users guideでの推奨濃度30uMより薄い濃度でも機能するか？

現時点では、本製品が特定の細胞に対してtoxicityを持つという報告はございません。
ただし、いくつかの細胞にとってはtoxicityがあることが問題になるかもしれません。

現時点ではIDTは30uMが推奨ですが、細胞によってはより少ない濃度で最適化する必要があるかもしれません。

お客様がご利用される細胞において、toxicityは有るか無いか？最適な濃度は？という点についてはお手数ではございますが、お客様のお手元でご検討ください。

Q.Alt-R S.p. Cas9 Nuclease 3NLSは購入可能か？

残念ながら2019年6月時点では、Alt-R S.p. Cas9 Nuclease 3NLSの再販予定はありません。

しかし、 Cas9 Nuclease V3は、Cas9 Nuclease 3NLSと比較して良好な結果が得られておりますので、まずは V3 をお試し下さい。
Cas9 Nuclease V3 とCas9 Nuclease 3NLS の比較データはこちら

また、過去の品番等はこちらをご参照下さい。

Cas9 Nuclease	価格	濃度	納品形態	Cat#
100 µg Alt-R™ S.p. Cas9 Nuclease 3NLS	¥23,400	10μg/μL	50% グリセロール	1074181
500 µg Alt-R™ S.p. Cas9 Nuclease 3NLS	¥83,400			1074182