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IDTテクニカルレポート vol.1


放射線医学総合研究所　研究基盤センター　生物研究推進課
塚本　智史（主任技術員）
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はじめに

TALENやCRISPR/Cas9に代表されるゲノム編集ツールの登場と普及によって、以前よりも格段にノックアウトマウスの作製が短時間かつ低コストで可能となっている。CRISPR/Cas9は、single guide RNA（sgRNA）と呼ばれる小分子RNAが標的DNAを認識して、sgRNAに誘導されたCas9ヌクレアーゼがゲノムDNAを切断する。したがって、CRISPR/Cas9を用いてゲノム編集を行うためには、標的遺伝子ごとに設計したsgRNAとCas9の2つの因子が必要になる。
通常は、専用に開発されたpX330ベクター[1]などにsgRNAの認識配列となるオリゴDNAをクローニングすることで、これら2つの因子を発現するベクターを構築する。しかし、筆者は人工の二本鎖DNAであるgBlocks®を用いることで、プラスミドを構築する手間なくsgRNAを精製し、Cas9ヌクレアーゼと共に受精卵へ顕微注入することでノックアウトマウスを作出している（次ページ図1参照）。本レポートでは、gBlocks®を利用したCRISPR/Cas9によるノックアウトマウスの作製法について解説する。

準備するもの

● T7プロモーターから転写可能なsgRNAの全長をコードする二本鎖DNA（gBlocks®，IDT-MBL KK）

● T7プロモーターから転写可能なCas9をコードするDNA（プラスミドやPCR産物など）
AddgeneやSigma-Aldrich Co. LLC.から入手・購入可能。最近では、Cas9のmRNAやペプチドも市販されている。

● mMESSAGE mMACHINE T7 ULTRA Transcription Kit（Life TechnologiesTM,Thermo Fisher Scientific Inc.）
Cas9 mRNA転写用

● MEGAshortscript T7 Kit（Life TechnologiesTM,Thermo Fisher Scientific Inc.）
sgRNA転写用

● MEGAclear Kit（Life TechnologiesTM,Thermo Fisher Scientific Inc.）
in vitroで転写したmRNAの精製に使用する。筆者は、フェノール・クロロホルムによる除タンパク質とエタノール沈殿でも精製しているが、MEGAclear Kitを使用した方がmRNAの回収量が多いようである。

● Surveyor® Mutation Detection Kits（IDT-MBL KK）
標的配列内の変異導入の有無を解析するためのキット（必要に応じて準備する。sgRNAの認識配列内に制限酵素配列がない場合など）。

● Ultrafree-MC centrifugal filter（Merck Millipore, Merck KGaA）
顕微注入の直前に本カラムを使って精製したmRNAから不純物を除去している。

● Guide-it sgRNA Screening Kit（タカラバイオ株式会社）
gBlocks®を鋳型にして精製したsgRNAの標的部位に対する切断活性を確認するためのキット。

● マウス
雌マウスは8?12週齢、雄マウスは9週齢以上、移植用仮親マウス（ICR/MCH、精管結紮雄と同居させて移植当日の朝に膣詮が確認できたもの）、里親マウス（ICR/MCH）。
筆者は、C57BL/6マウスの体外受精卵（1細胞、受精5時間目頃）を用いることが多いが、状況に応じて凍結しておいた1細胞も用いている。

● 受精卵へRNAを顕微注入するためのマニュピュレーターシステム
筆者はLeica Microsystems K.K.の顕微鏡（DMI3000B）とマニュピュレーターシステムを使用している。
インジェクション針はSutter Instrument Companyのピペットプラー（IVF-P98）を用いてその都度作製している。


プロトコル

ここでは図1に示した流れに沿って、実際に筆者が行っている方法を項目ごとに解説する。
gBlocks®を利用したCRISPR/Cas9による変異マウス作出の流れを示す。標的遺伝子のゲノム情報取得からgBlocks®のオーダーと納品、gBlocks®を鋳型にしたsgRNAの精製と切断活性の確認までに2週間、受精卵への顕微注入からマウスの誕生までに3週間の期間（最短で一ヶ月半ほど）で目的とする変異マウスの作出が可能となる。
1. sgRNAの標的配列の選定からgBlocks®のオーダー
対象となる遺伝子のゲノム情報をUCSC Genome Browse（http://genome.ucsc.edu/）などから入手して、sgRNAの認識配列を選定する。筆者は、Jack Lin's CRISPR/Cas9 gRNA finder（http://spot.colorado.edu/~slin/cas9.html）やGuide RNA Target Design Tool（https://wwws.blueheronbio.com/external/tools/gRNASrc.jsp）を用いて候補を2つほど選んでいる。通常、開始コドンの下流側の近傍でsgRNAの認識配列内に制限酵素サイトが含まれるものを優先的に選んでいる（制限酵素サイトがあると変異導入の有無が容易に解析できるため）。次に、T7プロモーターから転写できるようにsgRNAの全長（Buffer sequence + T7プロモーター配列+選定したsgRNA認識配列+ sgRNA scaffold：130 bp）[1,2]　をIDT-MBL KKの人工遺伝子合成受託サービス（http://ruo.mbl.co.jp/custom/custom_gene.html）内のgBlocks® Gene Fragmentを選択して注文する。図2にマウスのRhot1（ras homolog gene family, member T1）遺伝子を例にして、sgRNAの認識配列とgBlocks®のDNA配列を示した。gBlocks®は乾燥粉末品（200 ng）として納品される。筆者はこれを10 μlのDNase-RNase-freeの水で融解して8 μlを転写用の鋳型として使用している（残りはDNAの濃度測定や電気泳動に使っている）。gBlocks® 1本あたりのDNA含量は少ないが、一度の転写で十分量（数回の顕微注入分）のsgRNAが精製できるため問題とならない。

>> gBlocksの納品量は250ngに増量しました。（?250bp）
　 250bp?500bpでは、500ngの納品です。

A. Rhot1遺伝子エクソン１の開始コドンを緑色、sgRNA認識配列を赤字、認識配列内の制限酵素サイト（BamHI）を下線、PAM 配列を太文字で示す。 B. sgRNAを精製するために必要なgBlocks®の全長（130 bp）のDNA配列。5’末端側からBuffer Sequence（黒色）、T7プロモーター（緑色）、sgRNA認識配列（赤色）、sgRNA scaffold配列（青色）を示す。　
※ Buffer Sequence : 125 bp以上必要となるgBlocks®を合成するための配列。
2. gBlocks®を鋳型にしたsgRNAの転写とin vitroでの切断活性の確認
本法はプラスミドの構築を省略できるものの、事前に培養細胞などに導入して切断活性を確認することが出来ないのがデメリットでもある。その結果、受精卵に導入して移植後に生まれてくるマウスに変異が挿入されることを期待するしかなく不安も多い。そこで、筆者はタカラバイオ株式会社から最近発売されたGuide-it sgRNA Screening Kitを使うことで、事前にin vitroで合成したsgRNAの標的配列に対する切断活性を確認している。このキットには切断活性を確認するために必要な試薬が揃っており、標的配列を含む領域をPCRで増幅して、その精製産物と転写したsgRNAさらに付属のCas9ヌクレアーゼ（ペプチド）を試験管の中で1時間ほど反応させて、アガロースゲルで電気泳動することで、切断の有無を容易に確認することができる。筆者のこれまでの経験では、このキットで切断活性が確認されれば、受精卵へ導入した際にも高率に変異が起こる。なお、顕微注入に用いるCas9 mRNAは、T7プロモーターから転写できるCas9をコードするプラスミド（AddgeneやSigma-Aldrich Co. LLC.などから入手・購入可能）や転写に必要な領域をPCRで増幅して、その精製産物を鋳型として使用している。
3. RNA-injectionによる受精卵への導入とスクリーニング
標的遺伝子ごとに精製したsgRNAとCas9のmRNAのそれぞれを10-20 ng/μlと50 ng/μlになるようにTE溶液で希釈・混合して、Ultrafree-MC centrifugal filterを通して顕微注入に使用する。筆者は、体外受精5時間目頃の1細胞の細胞質へ顕微注入しているが、状況に応じて体外受精後に凍結しておいた受精卵も使っている。一回の顕微注入で使用する受精卵は60個前後を目安にして、翌日に正常に卵割した2細胞を2?3匹の偽妊娠マウスの輸卵管へ移植している。顕微注入やmRNAの質に問題がなければ、顕微注入した受精卵の8?9割が卵割する。なお、筆者は移植せずに余った受精卵がある場合は、数日培養して胚盤胞を用いて変異導入の有無を検討している。
4. 変異マウスの検出
尻尾（2?3 mm）を採取してProteinase Kを含んだ溶解液中で、一晩55℃で反応させて溶解する。その後に溶解液を95℃で3分処理してから高速遠心（14,000 rpm、3分）し、上清1 μlを直接PCR反応に用いている。筆者は二つの方法で変異導入の有無を確認している。一つ目は、標的配列を含んだ500 bp前後を増幅できるプライマーでPCRを行い、このPCR産物の一部を標的配列内にある制限酵素で消化して、切断の有無を変異導入の指標にしている。また必要に応じてSurveyor® Mutation Detection Kits（IDT-MBL KK）を用いて変異導入の有無も検討している。二つ目は、精製したPCR産物を用いて、さらに内部に設計したプライマーを用いてダイレクトシークエンスしている。アレル間の変異の違いなどをより詳細に解析する必要がある場合には、PCR産物をTAクローニングするなどして数クローン程度をシークエンスする。
著者所感）筆者の経験では、本法で作出した変異マウスは両アレルに変異を持つホモ型の変異であることが多い。この原因はよく分からないが、受精卵へ顕微注入するsgRNAやCas9のmRNA濃度や受精後の導入時間などが影響するのかもしれない。

実験例

マウスのRhot1遺伝子を標的にして、本法でRhot1変異マウスを作出した例を示す。デザインしたgBlocks®を鋳型に精製したsgRNAの切断活性を確認後に、Cas9のmRNAと混合して受精卵（C57BL/6Nマウス由来の体外受精卵： 1細胞）へ顕微注入した。顕微注入した1細胞（81個）のうち2細胞へ発生した76個の中から60個を仮親へ移植し、20匹の仔マウスが誕生した（図3 A）。仔マウスの尻尾からDNAを採取して変異導入の有無を検討したところ、すべてのマウスに変異が検出された（図3 B、C）。なお、誕生した仔マウスは外見上の異常は見当たらないものの、出生後数分以内に死亡した。この結果は、最近報告されたRhot1遺伝子を全身でノックアウトした場合に観察される表現型と一致するものであった[3]。これらのことから、死亡した仔マウスはRhot1遺伝子の両方のアレルに変異が導入されたことが推察される。

顕微注入後に発生した76個の2細胞のうち、移植した60個から20匹のマウスが誕生した（図3 A）。マウスの尻尾から抽出したゲノムDNAを用いて、標的配列を含む領域をPCRで増幅して制限酵素BamHIで処理してアガロースゲルに泳動した写真を示す（図3 B）。野生型（Wt：変異導入がない）マウスでは、増幅したPCR産物（560 bp：図3 B矢印）が切断され400 bpと160 bp付近の2本のバンド（図3 B矢頭）として検出された。一方で変異導入されたマウス（No.1～20）ではPCR産物の切断は確認されなかった（図3 B）。同様にSurveyor Mutation Detection Kitsを用いた解析から、変異導入されたマウス（No.1～20）でのみSurveyorヌクレアーゼで切断されたバンド（図3 C矢頭）が検出された（図3 C）。変異導入が予測されたマウス10匹（No.１～10）のシークエンス解析の結果を図3 Dに示す。波形データを解析した結果、10匹のうち4匹(No.1、8、9、10)は両方のアレルに同じ変異が導入されたホモ型の変異で、残りはアレルごとに異なったパターンの変異が導入されたヘテロ型の変異マウスであると考えられる（図3 B・C写真提供：放射線医学総合研究所　研究基盤センター　生物研究推進課　伊林恵美氏）。
著者注記）出生した20匹のマウスのうちNo.12はシークエンス解析によって両アレルの変異を確認している

まとめ

gBlocks®を用いる本法は、標的遺伝子ごとにsgRNAを発現するためのプラスミドを構築する必要がないため、大腸菌を使った組換え実験や配列確認といった作業を省略できるメリットがある。gBlocks®の価格も安価で、MBLのWebサイトからの注文後1～2週間で手元に届く。また、筆者が本法で作製した変異マウスを用いた解析からは、オフターゲット効果によるDNAの変異は見つかっていない。これらのことから、簡便さと正確さを備えたgBlocks®の利用は、CRISPR/Cas9システムによるノックアウトマウス作製の際には特に有効なツールである。
参考文献
[1] Cong, L. et al., Science. 339, 819-23, 2013. PMID: 23287718
[2] Chang, N. et al., Cell Res. 23, 465-72, 2013. PMID: 23528705
[3] Nguyen, T.T. et al., Proc Natl Acad Sci USA. 111, E3631-40, 2014. PMID: 25136135


gBlocks®のご紹介

gBlocks® Gene Fragmentsはプラスミドに入っていない二本鎖DNAを合成するサービスです。 本テクニカルレポートのCRISPR/Cas9 への利用のほかに、qPCRコントロール、コンストラクション、抗体のリコンビナント、酵素の基質、in vitro トランスクリプションなど、多種多様の用途に用いられております。
またその正確性から、クローニングを行なっていないgBlocks®や、そのgBlocks®を用いて転写したタンパク質によるスクリーニングも行われています。

詳細はこちら >>gBlocks® Gene Fragments：人工遺伝子合成受託サービス

Surveyor®のご紹介

Surveyor® Mutation Detection Kitsは、遺伝子やDNAの変異や多型を検出するキットです。

詳細はこちら >>遺伝子/ DNAの変異/多型検出キット： Surveyor® Mutation Detection Kits