rhAmpSeq amplicon sequencing system
サービス概要
rhAmpSeq（ランプSeq）システムは、RNaseH2酵素を用いた特異性の高いrhAmp Assay技術を、NGSのアンプリコンシーケンスに応用した製品です。rhAmpという特異性の高い技術を応用しているためプライマーダイマーができにくく、ライブラリも2回のPCRを行うだけで完成します。
rhAmpSeq プライマーセット
ご希望のターゲットを増幅するプライマーセットです。カスタムと設計済みのパネルをご用意しております。- Custom rhAmpSeq Panels – ご希望のターゲットに応じたマルチプレックスアンプリコンパネルを作成します。
- rhAmpSeq Sample ID Panel – ワークフローでのサンプル取り違えを確認する設計済みのパネルです。
ライブラリ調整試薬
- rhAmpSeq Library Kit - rhAmpSeqシステムを用いたライブラリ調製に必要な試薬を揃えたキットです。
インデックスプライマーセット
- rhAmpSeq Index Primers - rhAmpSeqプライマーで増幅したアンプリコンに、インデックス配列およびP5/P7配列を付加するプライマーです。インデックス配列を組み合わせることで、一度に多サンプルをシーケンスできます。
rhAmpSeqの概略図
rhAmpSeqの特徴
- rhAmp Assay技術により、プライマーダイマーを抑制します
- rhAmpSeqシステムでは、IDT社独自のrhAmp Assay技術が利用されています。
この技術では、DNA：RNA二本鎖を認識して切断するRNase H2酵素の特性と、Blocking部位を含むプライマーを使用しています。
これにより、マルチプレックスPCRの最大の懸念であるプライマーダイマーを最小限に抑え、PCRの増幅特異性を高めることができます。
» rhAmp Assay技術の詳細はこちらをご参照ください。
- PCR工程2回のみの簡便かつ低コストなワークフロー
rhAmpSeqシステムでは、2回のPCRでライブラリが完成します。
1回目のPCR（Targeted rhAmp PCR 1）ではrhAmp Assay技術を利用してターゲットを増幅し、2回目のPCR（Indexing PCR 2）でインデックス配列およびP5/P7配列を付加します。
ライブラリーの調製に必要な試薬は、rhAmpSeq Panels、rhAmpSeq Library Kit、rhAmpSeq Index Primersの3種のみです。
IDT社のアルゴリズムを用いてカスタム設計を行っており、「一度実験結果を取得しデザインを再検討する」等の最適化は行っておりません。
図1. パネルサイズとDNAインプット量ごとの高品質なシーケンスデータ
Coriell DNAサンプル10 ngおよび50 ngを用いて、ハイスループットプロトコールに従い、様々なサイズ（19、282、および994アンプリコン）のrhAmpSeqパネルの性能を評価しました。
994アンプリコンのパネルでは、10 ngおよび100 ngのサンプル量を用いてレギュラープロトコールの評価も行いました。
エラーバーは平均値からの標準偏差を示しています。
カスタムパネルの結果は、サンプル量や品質、生物種など、幾つかの要因によって異なる場合があります。
レギュラープロトコールとハイスループットプロトコールの違いに関しては、こちらをご参照下さい。
用途例
rhAmpSeqシステムは多種多様な研究用途に使用することができ、正確かつ効率的な結果を必要とする用途に適しています。下記はrhAmpSeq技術が使用されている分野の一例です。
農業技術への利用
シーケンスによるジェノタイピングは、分子育種や形質/マーカーのセレクションに利用されています。rhAmpSeqシステムは数個から数千のマーカーをセレクションすることができ、植物や動物の品種改良研究に役立ちます。
CRISPRゲノム編集
CRISPRによるゲノム編集は一般的な技術になりつつあります。 しかしながらCRISPRは、目的外のオフターゲットに作用することがあります。 カスタムrhAmpSeqパネルを使用すると、多くのCRISPR編集サイトを同時にすばやく調べることができるため、時間とリソースを節約できます。
疾患研究および検体の確認
疾患に関連する変異を検出することは、ヒト疾患研究において重要です。 rhAmpSeqシステムは特異性が高くマルチプレックス解析が可能なため、ホットスポットを簡便かつ正確に検出できます。 さらにrhAmpSeq Sample ID Panelパネルを使用すると、サンプルを追跡し、人為的ミスを防ぐことができます。
rhAmpSeqシステムの仕様
rhAmpSeqシステムは、1回のマルチプレックス反応で、数十から数千のアンプリコンにも及ぶパネルサイズでも安定した性能を発揮し、FFPEやcfDNA等の解析が困難なサンプルにも対応しています。
表1では、rhAmpSeqシステムの仕様をまとめています。
表1. rhAmpSeqシステムの機能と仕様
| プロトコールとサンプル量 | レギュラープロトコール（10-100 ng） ハイスループットプロトコール（10-50 ng） |
| 対応サンプル | 組織検体、FFPE、cfDNAなど |
| インサート長 | 通常50-200 nt |
| カスタムパネルサイズ | 1パネルあたり最大5,000アンプリコンまで |
| インデックス数 | P5およびP7で各96インデックス（最大9,216通り） |
| シーケンサー | Illumina |
2種類のプロトコール
rhAmpSeqシステムは、レギュラープロトコールとハイスループットプロトコールの2種類をご用意しております。
レギュラープロトコールは僅かに良好な結果を取得できますが、ハイスループットプロトコールは精製ステップを省略することで、ワークフローにかかる時間とコストの両方を削減することができます（表2）。
何れのプロトコールも自動化機器に対応しています。
表2. 最適なrhAmpSeqライブラリ調製プロトコールの選択
| 目的 | レギュラー プロトコール |
ハイスループット プロトコール |
|---|---|---|
| カバレッジの均一性を少しでも上げたい | ✓ | |
| FFPEやcfDNAサンプルのため少しでも良好な結果を取得したい | ✓ | |
| 時間をかけずにスクリーニングをしたい | ✓ | |
| ライブラリの定量やノーマライゼーションの必要がない | ✓ | |
| 作業時間* | 2.5–4.5 hr | 1–1.5 hr |
| ライブラリ調製の合計時間* | 4–6 hr | 4–4.5 hr |
rhAmpSeq amplicon sequencing system 製品詳細
Custom rhAmpSeq Panels
Custom rhAmpSeq Panelsは、プライマーダイマーを最小限に抑えることが可能なrhAmpプライマーを使用することで、マルチプレックス数を最大まで増やすこができ、かつ高品質なアンプリコンライブラリを作成します。
IDT社のバイオインフォマティシャンによるカスタムrhAmpSeqデザインサービスは、ユーザー様と1対1で相談しながら目的のパネルを作成します。
- ヒト、マウス、サル、トマト、トウモロコシ、グレープなど、様々な動植物用のカスタムパネルをデザインします。
- 最大5,000アンプリコンまで一度に効率的なマルチプレックスが可能です。
- ご希望のプロジェクトに応じた3つのスケールをご用意しています。
| Product | Price (per primer pair) |
|---|---|
| Custom rhAmpSeq™ Panel, 0.4 nmol | ¥2,800 |
| Custom rhAmpSeq™ Panel, 4 nmol | ¥4,400 |
| Custom rhAmpSeq™ Panel, 8 nmol | ¥5,500 |
Custom rhAmpSeq Panelsは、パネルサイズ（アンプリコン数）に応じてrhAmpプライマー濃度を調整することをお勧めしており、0.4 nmolの最小スケールでも800回反応を行うことが可能です。
設計に関して
IDT社カスタム設計は、下記2つのステップを行うことで、他のアンプリコンシークエンシングを上回る性能をご提供します。
- Assay Design - 各ターゲットのrhAmpプライマーデザインの設計時に、プライマーダイマーや非特異的な増幅等のオフターゲット等、その他広範囲なターゲットを含めて確認します。
- Virtual assay pooling - rhAmp PCR技術の特異性をさらに高める、ユニークなマルチプレックスプライマーQC機能です。全体的な反応効率を低下させたり、マッピング率を減少させるプライマーダイマーを、より正確に予測することができます。
Custom rhAmpSeq Panelsを注文する前に、デザインの詳細レポートを提供しています。
デザイン結果を確認し、必要に応じてデザインを繰り返すことが可能です。
Custom rhAmpSeq Panelsは、ターゲットSNPおよびindel用に設計されています。
現在のところ、遺伝子全体の解析やアンプリコンが重複するデザインを提供していませんが、今後のアップデートにより、サービス範囲を広げることを予定しています。
設計のご依頼方法
こちらの製品ページより必要事項をご入力頂くと、IDTの米国担当者と相談しながら設計を進めることができます。英語での相談が不安な場合や、ご不明な点はカスタマーサポート（日本法人）までお問い合わせ下さい。
通常設計には1-2週間程度お時間を頂いております。混雑具合や設計の複雑さにより、通常よりお時間を頂く場合がございますので、予めご了承下さい。
rhAmpSeq Sample ID Panel
5箇所の性別識別用マーカーを含む、76のrhAmpプライマーペアで構成されており、対応するSNPマーカーを増幅して、NGSワークフロー中の正確なサンプル確認を行います。
xGen Human ID Research Panelで使用されているものと同じく非常に多型性の高いSNPを使用しており、2500万を超えるサンプルから識別することができます。
- ヒトDNAサンプルを用いたワークフローで、正しいサンプルを識別できます。
- 再現性の高いターゲットシークエンシングデータを迅速に作成できます。
- FFPEやcfDNAなど、取り扱いが難しいサンプルでも取り違えの不安をなくして作業できます。
| Product | Catalog # | Price |
|---|---|---|
| rhAmpSeq™ Sample ID Panel, 16 rxn | 10000082 | ¥8,900 |
| rhAmpSeq™ Sample ID Panel, 96 rxn | 10000083 | ¥42,500 |
表4の計算モデルでは、SNP数に応じて同じ遺伝子型を持つサンプルの確率を示しています。サンプルには韓国の方を使用しております。
表4. ある2サンプルをrhAmpSeq Sample ID Panelで検出した場合、同じ遺伝子型を持つ確率の計算値
| SNP数 | 同じ遺伝子型を持つ確率（2,500万サンプルの場合） |
|---|---|
| 45+ | 427/25,000,000 |
| 46+ | 158/25,000,000 |
| 47+ | 57/25,000,000 |
| 48+ | 18/25,000,000 |
| 49+ | 6/25,000,000 |
| 50+ | 2/25,000,000 |
| 51+ | 0* |
確実かつ再現性の高いオンターゲット率と均一なカバレッジ
rhAmpSeq Sample ID Panelは、多様なヒトサンプルや量に対して、特異性が高く均一なカバレッジを取得し、SNPが解析できるように開発されています。
図2. ヒトサンプル種や量に関わらず、確実で再現性の高いオンターゲット率と均一なカバレッジが取得可能
2人のCoriellサンプル10 ngおよび50 ngから、ハイスループットプロトコールを用いて性能評価を行ったところ、90%以上のオンターゲット率と、85%以上の0.2×平均カバレッジを取得できました。
取り扱いが難しいサンプルに有用
FFPEやcfDNAに対して、rhAmpSeq Sample ID Panelの性能を評価しました。図3に5人のドナー由来のサンプルを検討した結果を示しており、いずれのドナーおよびサンプル種でも、サンプル識別に十分なデータを取得できました。
また表5では、これらのサンプルの一致率を示しています。
図3. FFPEやcfDNAサンプルでのrhAmpSeq Sample ID Panelの結果例
5人の異なるドナーから、3種類のDNA（血漿由来のcfDNA、肺腫瘍組織由来のFFPEから抽出したgDNA、正常細胞由来のgDNA）を単離しました。
レギュラープロトコールに従って、1 - 5 ngのDNA量を用いてすべてのサンプルを調製しました。
マッピングされたリードの割合、オンターゲットリードの割合、カバレッジの均一性（≥0.2×平均カバレッジ）、およびコール率を示しています。
例えば●ドナー1の結果は、下記の通りです。(cfDNA,FFPE,gDNAで共通)
マッピングされたリードの割合：99%
オンターゲットリードの割合：99%
カバレッジの均一性：96%
(≥0.2x 平均カバレッジ)
コール率：96%
※FFPEやcfDNAに関してはサンプルの品質によって結果が異なる場合があるので、ご注意下さい。
表5. 遺伝子型の一致率
FFPE = FFPE gDNA (肺腫瘍組織由来)、gDNA = gDNA (正常細胞由来)、cfDNA = cfDNA 血漿由来)となります。
rhAmpSeq Library Kit
- rhAmpSeq Library Mix 1 – ターゲット配列増幅用のPCR（1回目）に使用するマスターミックスです。
- rhAmpSeq Library Mix 2 – インデックス配列およびP5/P7配列を付加するPCR（2回目）に使用するマスターミックスです。
| Product | Catalog # | Price |
|---|---|---|
| rhAmpSeq™ Library Kit, 16 rxn | 10000064 | ¥40,000 |
| rhAmpSeq™ Library Kit, 100 rxn | 10000065 | ¥221,300 |
| rhAmpSeq™ Library Kit, 500 rxn | 10000066 | ¥995,800 |
| rhAmpSeq™ Library Kit, 5000 rxn | 10000067 | ¥8,851,900 |
図4. rhAmpSeq Library Kitは異なるロットでも安定した性能
3ロットのrhAmpSeq Library Kitを評価しました。各ロットは10 ngおよび50 ngの多様なCoriellサンプルを用いて、ハイスループットプロトコールに従い、rhAmpSeq Sample ID Panelで増幅しました。
各ロットあたり32サンプルを使用しています。カバレッジの均一性は≥0.2×平均カバレッジの割合を示しています。
rhAmpSeq Index Primers
デュアルインデックスライブラリが作成され、一度のシーケンスで多サンプルの処理が可能になります。
- P5：96インデックス × P7：96インデックスで最大9,216サンプルの識別が可能です。
- rhAmpSeq Library Kitを使用して、簡単にライブラリを調製できます。
| Product | Price (per primer pair) |
|---|---|
| Index Primers (tube or plate) | ¥1,300 |
例えば96サンプルなら、P5を12インデックスとP7を8インデックス（96通り）のインデックスプライマーを使用することで、1度のシーケンスですべてのサンプルを解析できます。
また、P5を4インデックスとP7を4インデックス購入して計16通りとし、6回シーケンスを行うことも可能です。（16 Sample/Seq x 6 Seq = 96 Sample)
rhAmpSeq Index Primerは、表6に示すように、プロトコールによって使用量および反応回数が異なります。
表6. 必要なインデックスプライマーの量と使用可能な反応回数
| プロトコール | 1反応あたりのプライマー濃度 | 納品量6 nmolで使用可能な反応回数 |
|---|---|---|
| レギュラー | 500 nM | 600 |
| ハイスループット | 100 nM | 3000 |
価格例
①サンプル数：96
アンプリコン数：80-plex
| 使用試薬 | 単価 | 数 | 計 |
|---|---|---|---|
| Custom rhAmpSeq™ Panel, 0.4 nmol | ¥2,800 | 80 | ¥224,000 |
| rhAmpSeq™ Library Kit, 100 rxn | ¥221,300 | 1 | ¥221,300 |
| Index Primers (tube or plate) | ¥1,300 | 20* | ¥26,000 |
| 合計 | ¥471,300 | ||
rhAmpSeqの性能を試したい場合、下記のような実験系も組むことができます。
②サンプル数：16
アンプリコン数：20-plex
| 使用試薬 | 単価 | 数 | 計 |
|---|---|---|---|
| Custom rhAmpSeq™ Panel, 0.4 nmol | ¥2,800 | 20 | ¥56,000 |
| rhAmpSeq™ Library Kit, 16 rxn | ¥40,000 | 1 | ¥40,000 |
| Index Primers (tube or plate) | ¥1,300 | 8* | ¥10,400 |
| 合計 | ¥106,400 | ||
1サンプルあたりの価格に関して
各試薬では、一度ご購入頂くと、Custom rhAmpSeq™ Panelであれば最低800サンプル（表3）、
rhAmpSeq Index Primersは600反応分（表6）の実験を行えます。
そのため、1サンプルあたりの価格はrhAmpSeq™ Library Kitの価格から概算できます。
| 使用試薬 | 価格 | 処理可能サンプル数 | 1サンプルあたりの価格 |
|---|---|---|---|
| Custom rhAmpSeq™ Panel, 0.4 nmol | ¥2,800 | 800〜 | ¥3.5〜 |
| Custom rhAmpSeq™ Panel, 4 nmol | ¥4,400 | 8,000〜 | ¥0.6〜 |
| Custom rhAmpSeq™ Panel, 8 nmol | ¥5,500 | 16,000〜 | ¥0.3〜 |
| rhAmpSeq™ Library Kit, 16 rxn | ¥40,000 | 16 | ¥2,500 |
| rhAmpSeq™ Library Kit, 100 rxn | ¥221,300 | 100 | ¥2,213 |
| rhAmpSeq™ Library Kit, 500 rxn | ¥995,800 | 500 | ¥1,992 |
| rhAmpSeq™ Library Kit, 5000 rxn | ¥8,851,900 | 5,000 | ¥1,770 |
| Index Primers (tube or plate) | ¥1,300 | 600または3,000 | ¥2.2〜 |
プロトコールおよびサンプルデータ
» IDT rhAmpSeq amplicon sequencing systemページ ▼Resources
Q&A
Custom rhAmpSeq Panelの保管期限を教えて下さい。
-20℃で2年間です。ただしForwardとReverseのプールはパフォーマンスが低下するため、別々に保管してください。
rhAmpSeq製品は何回の凍結融解が可能ですか？
最大10回までを推奨しております。必要に応じて分注して保管して下さい。
IDTE bufferの代わりに1× TE bufferを使用できますか？
使用できません。IDTE bufferは10 mM Tris、0.1 mM EDTAの組成となっていますが、1× TE bufferは10 mM Tris、 1 mM EDTAとなっていることが多く、EDTAの量が多いため、rhAmpSeqではPCR反応の効率が下がる場合があります。IDTE bufferか、同じ組成に調製したTE bufferをご使用下さい。
どのくらいのサンプル量が必要になりますか？
精製済みの通常gDNAの場合、レギュラープロトコールは10-100 ng、ハイスループットプロトコールは10-50 ngです。
500-plex以上のCustom rhAmpSeq Panelsの場合、10×のプライマープールはどのように計算、作成すればよいですか？
下記の計算式をご参照の上、ForwardおよびReverseそれぞれで10×プライマープールを作成下さい。
一例として800-plexの場合ですと、下記になります。
Custom rhAmpSeq Panelsでtilingを厚くしたり、遺伝子全体をカバーするような設計はできますか？
現在のところ出来ません。重なり合うアンプリコン同士が反応してしまうためです。rhAmpSeqは基本的にSNPやindelをターゲットとしており、各ターゲットで600 nt以上間隔をあけることを推奨しています。