ユーザーボイス of gBlocks Gene Fragments
制限酵素処理不要の新しいクローニング技術と長鎖二本鎖DNAを用いて簡単にベクターを構築する方法
In-Fusion® HD Cloning Kit (タカラバイオ)と gBlocks(IDT)を用いることで、制限酵素とライゲーションを用いるよりも、短時間で簡単なクローニングを行うことができ、簡便にコンストラクトの構築が可能です。
実際にご利用頂いた先生に、gBlocksとIn-Fusionを用いたベクター構築の実施例をご提供いただきましたので、紹介させていただきます。
In-Fusion試薬を用いたgBlocks導入方法の概略図
In-Fusion試薬は、それぞれのDNA断片の末端15bpが相同であれば、それらのDNA断片を結合させる試薬です。gBlocksと組み合わせることで、短時間で効率よくクローニングを行うことが可能です。
実例紹介の前に、まずは導入方法についての概略を図示させていただきます。
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gBlocks(IDT)で作製したインサートフラグメントと、In-Fusion® HD Cloning Kit (タカラバイオ)を用いた簡便なクローニングの実施
実験例1
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福島県立医科大学 医学部付属生体情報伝達研究所 細胞科学研究部門 荒井斉祐 先生 和田郁夫 先生 |
- クローニングの目的
発現制御を行うベクターの作製 - 使用したベクター
約4100 bpのプラスミド - gBlocksで合成した遺伝子
改変された転写因子結合タンパク、末端配列にはベクター末端15塩基を含めた。
gBlocks 塩基数：750 bp - 実験操作
ベクター：0.2 μg、gBlocks DNA： 0.1 μg
ベクターは、inversePCR により直鎖化したものを電気泳動してゲルから精製。
In-Fusionのプロトコールに従って反応を行った。 - 結果
大量のコロニーが形成され、４つのコロニーを調べたところ、いずれも設計通りのDNA 配列を持つプラスミドが得られた。 - 感想
複数箇所の変異を持つcDNAを得るためには、以前はRT-PCRによりcDNAを調製してmultiple mutationを行う必要があったが、gBlocksを用いる事で、コストを抑え、ほぼパソコンの作業だけですむようになった。
さらにIn-Fusionを使うことで、目的とするプラスミドが容易に完成され、全体として作業に用する時間と手間を大幅に減らせるようになった。
実験例2
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京都大学ウイルス・再生医科学研究所 細胞機能調節学分野 細川暢子 先生 |
- 研究テーマ
タンパク質のフォールディングと品質管理機構 - gBlocksで合成した遺伝子
ヒトタンパク質の部分配列 アミノ酸数：187 aa
gBlocks塩基数：597 bp - プロトコル
In-Fusionのプロトコールに従って、gBlocksをデザインした。
Vectorは制限酵素で切断して直鎖化し、In-Fusionのプロトコールに従って反応させた（50℃、15分）。
試薬 容量 vector 100 ng gBlocks vectorの３倍量（モル比） In-Fusion 2µl 合計 10µl - 結果
大腸菌にトランスフォーメーションしたのち、６個のコロニーをミニプレップしたところ、全てのクローンにインサートが挿入されていた。
４つのクローンについてシークエンス反応を行って配列を確認したところ、３つのクローンでは全ての配列に問題が無かった。1つのクローンにおいて、１塩基の変異があった。 - gBlocksを利用した理由
今回クローニングしたい目的タンパク質は、通常のクローニング過程で塩基配列に変異が入りやすいため。 - 感想
常にコンストラクションに苦労する遺伝子であるが、今回gBlocksを利用することで、１回で目的のタンパク質フラグメントをクローニングすることが出来た。
In-Fusionを利用することで短時間のプロセスでクローニング可能で、すぐに実験を行い、良好な結果を得ることが出来た。
製品フォーカス
gBlocks® Gene Fragments：人工遺伝子合成受託サービス
gBlocks Gene Fragments とは、任意の二本鎖DNAを合成するサービスです。プラスミドに導入された状態（環状）ではなく、線状として納品するため、納品後すぐにIn-Fusion試薬などによるベクターへの導入が行えます。プラスミドへの導入を行わないため、納期も短く価格も安価に提供できるので、年々広がっているサービスです。
gBlocksの合成可否はご注文時に確認でき、合成状況もIDTウェブサイトから確認することができます。
詳しくはこちらをご参照ください。