IDTでは、Locked Nucleic Acid (以下 LNA)を下記の条件下で合成可能です。

1. 5'末端に蛍光色素、3'末端にクエンチャーがあるDNAオリゴヌクレオチドであること
2. 長さ：10 ～ 25 塩基
3. LNA個数：1 ～ 6個

価格・納期等、詳細はこちらをご確認下さい。

(2)(3)については、上記条件から外れても特別注文として合成出来る場合があります。
是非一度配列をお見せ下さい。

LNA Designed
To：japan-cc@idtdna.com

1. 最小合成スケール：250nmole
2. 保証収量：少なくなります
3. 加算料金：特別注文費用がかかる場合もあります。

こちらの [LNA/デザイン依頼] メールフォームに「種名」、「SNPを中心とした前後200 bpの配列」、及び「アレル情報」をお送り下さい。
設計に少しお時間を頂戴いたしますが、配列を設計させて頂きます。（1?4営業日）
ただ、設計したプローブがSNPsの識別を保証する物ではございませんこと、ご留意下さい。

LNAのTm値を算出するには、下記のツールを用います。
まずは下記のツールにアクセスして下さい。
>> BioPhysics (IDT website)

1. パラメーターを下記の様に3ヶ所変更して下さい。
   
   ※上記パラメーターは、一般的なマスターミックスの濃度です。ミックスの濃度が分かっている場合は、その濃度を入力して下さい。
   パラメーターを変更する事で大きくTmが変わるので、出来るだけ正確に入力して下さい。
   このパラメーターによって この様 にTmが変わります。
   
   
   
2. 設計予定のプローブの配列を入力し、CALCULATE をクリックして下さい。
   
   ※LNAは塩基の前に「+」を入れて下さい(例：G+GAT...)。
   SNP検出でない場合は、全体に均等にLNAを入れる事をおすすめします。
   
   
   
3. しばらくすると、下記の様にTm値等が算出されます。
   
   
   
   

1. 今回は、例として下記SNPの検出用プローブを設計したいと思います。
   ※1.GとAのアレルを区別する場合、+GとTの安定性が高く Mismatch と Exact Match でTm値の差が出にくいため、相補鎖側にプローブを設計する必要があります。

   Wild Type：	ACCTAAATGCAAGTAGCCACTAAGGAGGCG
   SNP：	ACCTAAATGCAAGTCGCCACTAAGGAGGCG

   
   
2. まず、SNPとその両端をLNAにします。
   ACCTAAATGCAAG+T+A+GCCACTAAGGAGGCG
   
   
3. SNPサイトを中心に、左右10bp程度の配列を選択します。
   AAATGCAAG+T+A+GCCACTAAGG
   
   
4. この配列をSequence欄に入力し、その下にあるMismatch, Danglong Endsにチェックを入れます。
   
   
   
   
5. INTRODUCE MISMATCHがSequence欄の下部に表示されますのでSNPの相補鎖の塩基を入力します。
   (例では下図の赤四角、Cの相補塩基対のGを入力します）
   その後、CALCURATEをクリックします。
   
   
   
   
   
6. 下記の様な計算結果が表示されます。
   
   
   
   
   
7. 大体の差異を確認したら、長さを調節します。
   出来るだけSNPサイトが中心になるように、両末端からそれぞれ1塩基或いは2塩基ずつ削り、[Mismatch：55℃、Exact match：64～65℃]よりも少し低くなる様にします。
   その際、5'末端はG以外にして下さい。消光作用があるためです。
   
   さらに、配列を変更する毎に下記の青四角にも塩基を配置して下さい。
   上部がプローブ、下部がサンプルのDNAですが、プローブがハイブリダイズするDNAの両側の塩基もプローブのTm値に関係するためです。
   
   
   下図が上記のCALCULATE結果です。
   
   DNA側の塩基を入力しない場合のTmはこの様になります。
   
   
8. 最後にDNAをLNAに変換します。
   1～3個のLNAを両末端以外でSNPよりできるだけ離す様に配置し、下記条件に合致する配列を探します。
   [Mismatch：55℃以下、Exact match：64～65℃、Difference：10℃以上]
   
   ピリミジン（T,C)をLNAにするとTmが上昇しやすく、プリン (A,G)は1つ前の塩基がプリンの場合のみTmが上昇しやすいです。
   プリン - プリンLNA の例 (A+G、A+A、G+G、G+A)
   
   
   
   

1. バッファーの初期パラメータを変更しないで、Tm値を計算した場合
   
   


2. Mismatch のアレルとTm値の変化
   下記論文のTable1に詳細がございます。
   Yong You et al.,Design of LNA probes that improve mismatch discrimination.Nuc Acid Res.vol.34(8):e60(2006)
   (doi: 10.1093/nar/gkl175)
   +G - T 以外は顕著なTmの乖離が見られます。
   
   
3. テンプレートとなるDNAの両端の塩基を入力しなかった場合
   


4. LNAにする場所と上昇するTm値の関係
   
   2 ～ 5及び11～14について、1塩基ずつA→ +A → T → +T … → +C の順に置換し、それぞれの場所においてLNAに置換した場合、Tmがどの様に変わるのかを調べました。
   例えば、 [ 2. A → +A 1.32 ] は、2塩基目のG を Aと+Aに置換した場合のTmの変化は1.32℃であった事を示しています。
   
   試行数が少ないため、LNAへの置換位置とTmの変化は分かりませんでした。
   Py （T,C)はLNAにするとTmが上昇しやすくPu (A,G)は1つ前の塩基がPuの場合は、LNAにするとTmが上昇する傾向がありました。