ほとんどの加水分解プローブ（Dual-Labeledプローブ）は、5’末端と3’末端の間に約20〜30塩基の間隔をあけて、蛍光色素と1つのクエンチャーが修飾されています。蛍光色素とクエンチャーとの間の相互作用のレベルは、プローブの長さによって決まります。

IDT ZEN^™PrimeTime^®プローブには、従来品と同様5′末端に蛍光修飾と3′末端にクエンチャーが含まれていますが、プローブの5′末端から9番目と10番目の塩基の間に、さらにもう１つZEN^™クエンチャーを組み込んでいます。このZEN^™が入ることで蛍光色素からの距離が短くなり、プローブのバックグラウンドが減少し、シグナル検出の感度が高くなります。

ニュージーランドに拠点を置く核酸分離キットのメーカーZyGEM社[1]は、qPCRアッセイにおいて、IDT のZENダブルクエンチャープローブと従来のシングルクエンチャープローブの性能を比較する研究を行いました。プライマーとプローブの配列は同じで、使用するクエンチャーのみを変えて実験を行いました。

全てのプローブは、5′末端にFAM^™色素（Applied Biosystems）が修飾されています。3′末端のクエンチャーは、TAMRA^™クエンチャー（Applied Biosystems）、ブラックホールクエンチャー^™ (BHQ^™、Biosearch Technologies）、そしてInternalにZEN クエンチャーと3′末端にIowaBlack^™蛍光クエンチャー（IBFQ）を修飾した場合で比較を行いました。

図1は、ヒトBRCA1遺伝子のqPCRの結果です。2種類のシングルクエンチャーのプローブと比較して、ZENが挿入されたダブルクエンチャープローブのバックグラウンドが有意に少ないことを示しています。



図1：ZEN^™ダブルクエンチャープローブは、優れたS/N比を実現します。
ヒトDNA（5ng）をTemplateに、Quanta Accustart ^™Taq PCR Supermixで、フォワードプライマーとリバースプライマー（それぞれ0.2μM）、3種類のプローブ（本文参照）を用いて増幅しました。プローブ濃度は、0.1μMで最適な結果が得られました。ZENダブルクエンチャープローブは、TAMRAまたはBHQ^™のシングルクエンチャープローブと比べて、バックグラウンドの蛍光およびバックグラウンドシグナルのいずれにおいても優れていることが示されました。（David Saul [ZyGEM]提供）

さらにZENダブルクエンチャープローブは、従来のシングルクエンチャープローブと比較して低いCq値を示しました。IDTは、ZENプローブの平均Cq値を他の4つのシングルクエンチャープローブと比較する実験を行いました。プローブの配列とレポーターの蛍光色素は全て同じで、クエンチャーのみを変更しています。いずれのテンプレート濃度においても、ZENプローブが、最も低い平均Cq値を示しています（図2）。



図2：ZEN ^™ダブルクエンチャープローブは、シングルクエンチャープローブよりも平均のCq値が低い。
5’末端にFAMを標識したプローブに、5種類の異なるクエンチャーを修飾しました。クエンチャーは、ZEN^™とIowaBlack^™FQのダブルクエンチャー（ZEN / IBFQ）、Black Holeクエンチャー^™（BHQ）、Eclipse^™（Epoch Biosciences）、Iowa Black FQのみ（IBFQ）、TAMRAの5種類です。
それぞれのクエンチャーで10回、合計で50回のqPCRを行いました。各反応は、ACTB遺伝子座の領域を標的とする同一のプライマーおよびプローブ配列を用いています。TemplateはcDNAを段階希釈し、三連で実験を行いました。標準曲線は、反応あたり5ng のcDNAから10倍希釈段階を用いた5-logの結果です。Applied Biosystems 7900HT Real-Time PCR システムの標準サイクル条件下で、Applied BiosystemsTaqMan^™のマスターミックスを用いて反応を行いました。

バックグラウンド蛍光を減少させるIDTの ZENプローブは、シグナル検出を大幅に改善します。さらに、レポーター色素とZENクエンチャーの距離が短いため、40塩基の長さのプローブであっても消光状態にしておくことができます。これにより、A / Tリッチなプローブも実用的なTm値を有する配列の設計ができ、設計の柔軟性が高まります。これらの機能により、ZENダブルクエンチャープローブは、既存のアッセイの課題を解決し、新しいプローブデザインを可能にします。

1.　Tsuei A, Saul D. (2010) Sample normalisation with RNAGEM^™ and qPCR using an IDT ZEN PrimeTime probe. ZyGEM (Hamilton, New Zealand), internal report.
2. 原文：Decrease qPCR background, improve qPCR signal
3. 翻訳：安井 孝彰

PrimeTime^®qPCRアッセイ

加水分解プローブを用いたのアッセイは定量的遺伝子発現解析のゴールドスタンダードです。
プローブ法、インターカレーター法ともに、ヒト、マウス、ラットに関してはIDTが設計したプレデザインのアッセイ検索を行うことができます。プレデザインはIDT独自のバイオインフォマティクスアルゴリズムを用いて設計し、NCBIの最新の配列情報を参照しています。
PrimeTimeについて、詳しくはこちらをご覧ください。

ダブルクエンチャープローブ

IDTは、ZEN^™ダブルクエンチャープローブに加えて、新たにTAO^™ダブルクエンチャープローブを提供しています。どちらも、5′末端に蛍光修飾、Internalクエンチャー（ZENまたはTAOクエンチャー）、3′クエンチャーとしてIowa Black（アイオワブラック）を有しています。これらのプローブは、従来のシングルクエンチャープローブと比較して、低いCq値を示し、精度も向上しています。
ダブルクエンチャープローブとバックグラウンドについて、詳しくはこちらをご覧ください。

gBlocks^® Gene Fragments

gBlocks Gene Fragments 合成サービスは、125-3000 bpの二本鎖DNAを合成する人工遺伝子合成サービスです。gBlocksは、遺伝子の構築や改変のアプリケーションだけでなく、qPCRコントロールおよびスタンダードに使用することもできます。リーズナブルな価格で利用できるgBlocksは、プラスミド形態の人工遺伝子合成サービスと比較して、納期が短いため時間を節約することができます。またgBlocksは弊社QCをパスした高いクオリティを誇っています。
gBlocksについて、詳しくはこちらをご覧ください。

病気を検出や治療の有効性のモニタリングにZENやTAOのダブルクエンチャープローブが実際に役立っている例を紹介します。

ジカウイルスとPrimeTime

IDTはジカウィルスの流行拡大を阻止することを目的とした世界中の研究を支援しています。ウィルスについて、そしてIDT製品（ZENダブルクエンチャープローブ、IDTPrimeTime^™qPCR Assays、gBlocks）を用いた最新の開発状況についてまとめています。

低コピー数のHIV検査におけるddPCRのパフォーマンスの向上

ZENダブルクエンチャープローブは、ddPCRにおいてその性能を発揮します。バックグランドが低いZENダブルクエンチャープローブは、低コピーのサンプルを高感度に検出できることをMatthew Strain博士の研究室が示しました。Strain博士の研究室では、HIVを検出するためのZENダブルクエンチャープローブのデザインを含む最新のプロトコルを bio-protocolの1つとしてオープンアクセスで公開しています。(Go to bio-protocol)

臨床検体中のウィルス検査のための最適化されたqPCR Assays

ZENダブルクエンチャープローブが独自のqPCR実験に使用されています。迅速性と正確性を備えた、この検出方法は多様性に富む臨床検体中のノロウィルスの検出にも役立ちます。

ダブルクエンチャープローブはウィルス負荷の検出において、qPCR Assayの感度を向上させる

ZENダブルクエンチャープローブはクエンチャーが一つしかないTaqMan^™プローブと比較すると、顕著にバックグランドの蛍光を減らすことができます。このデータは、ダブルクエンチャープローブがより良い方法であることを示唆しています。

フィールドにおける感染症や生物学的脅威のマルチプレックスqPCRを用いた検査の最適化

Tetracoreの研究者は、プローブ法によるリアルタイムPCRについて、ロバスト性のある多数のセットを開発することを専門としています。ここで取り扱うセットは、マルチプレックスで、感染症やバイオテロ対策の検査に使用できます。Tetracore社がアッセイ系を確立するために必要とすることは3つあります。1つ目は、一般的に使用されるPCR機器と互換性があること、2つ目は、マルチプレックスで使用してもバックグラウンドが低いこと、そして、3つ目はウィルスの変異に応じて、アッセイ系を改良することです。ここではZENダブルクエンチャープローブがこれらの基準を満たすために、どのように役立っているか説明します。